Wie funktioniert Western Blotting?

Western Blotting ist eine molekularbiologische Technik, die zum Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Probe verwendet wird. Es verwendet SDS-PAGE, um Proteine ​​nach ihrer Größe zu trennen, und diese getrennten Proteine ​​werden dann in eine Membran transferiert. Diese Technik verwendet spezifische Primärantikörper bei der Markierung eines bestimmten Proteins im Blot. Sekundäre Antikörper, die mit Reporterproteinen markiert sind, erkennen die markierten Proteine ​​mit dem primären Antikörper.

Wichtige Bereiche

1. Was ist Western Blotting?
     - Definition, Fakten, Anwendungen
2. Wie funktioniert Western Blotting?
     - Prozess des Western Blots

Schlüsselbegriffe: Farbentwicklung, Nitrocellulose-Membran, Primärantikörper, Sekundärantikörper, Western Blotting

Was ist Western Blotting?

Western Blotting ist eine Hybridisierungstechnik, die zur Detektion eines bestimmten Proteins in einer Probe verwendet wird. Es wird auch als Immunoblotting bezeichnet, da die Technik Antikörper verwendet, um sowohl das interessierende Protein als auch den Nachweis der mit Antikörper markierten Proteine ​​zu markieren.

Abbildung 1: Western Blot

Western Blotting wurde 1979 zum ersten Mal von Towbin entwickelt und wird derzeit als Routineverfahren der Proteinanalyse eingesetzt. 

Wie funktioniert Western Blotting?

Western Blotting wird hauptsächlich beim Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Probe verwendet. Die Schritte der Western-Blotting-Technik werden nachstehend beschrieben.

1. SDS-PAGE - Die Proteinprobe wird anhand ihrer Größe durch SDS-PAGE getrennt.
2. Übertragung von Proteinen auf eine Membran - Die größenfraktionierten Proteine ​​werden entweder in eine Membran aus Nitrocellulose oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) überführt. Die mit dieser Übertragung verbundenen Techniken sind Diffusionstransfer.
3. Blockieren nicht spezifischer Sites - Die nicht besetzten Stellen auf der Membran werden blockiert, um die unspezifische Bindung von Proteinen zu verhindern. Zu diesem Zweck kann fettfreie Trockenmilch oder Rinderserumalbumin (BSA) verwendet werden.
4. Primäre Antikörperinkubation - Die blockierte Membran wird mit einer primären Antikörperlösung inkubiert. Diese primären Antikörper binden an ein bestimmtes Protein auf der Membran.
5. Sekundäre Antikörperinkubation - Die Membran wird mit sekundären Antikörpern inkubiert, die an die primären Antikörper binden. Sekundäre Antikörper werden an Reporterproteine ​​konjugiert. Diese Reporterproteine ​​können Biotin, alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase sein.
6. Proteinnachweis durch Farbentwicklung - Die konjugierten Enzymreporter reagieren mit ihrem Substrat, um eine gefärbte alkalische Phosphatase zu erzeugen, die BCIP in ein blaues Farbprodukt umwandelt, während Meerrettichperoxidase Luminol umwandelt und dabei Lumineszenz emittiert.

Abbildung 2: Western Blot - Verfahren

Fazit

Western Blotting ist eine Hybridisierungsmethode, die zum Nachweis der Anwesenheit eines bestimmten Proteins in einer Probe verwendet wird. Es verwendet SDS-PAGE, um Proteine ​​nach ihrer Größe und Bindung mit Primärantikörpern zu trennen, die während der Farbentwicklung von Sekundärantikörpern erkannt werden können.

Referenz:

1. "Western Blot-Grundprinzip, wie Western Blots funktionieren" Boster, Hier verfügbar.

Bildhöflichkeit:

1. "Anti-Liponsäure-Immunoblot" von TimVickers - Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia
2. "Western Blotting" von Cawang - Eigene Arbeit (CC0) über Commons Wikimedia