Was ist der Unterschied zwischen direktem und indirektem ELISA?

Das Hauptunterschied zwischen direktem und indirektem ELISA ist das Im direkten ELISA wird der primäre Antikörper direkt an das Nachweisenzym konjugiert, während im indirekten ELISA ein sekundärer Antikörper, der zum primären Antikörper komplementär ist, mit dem Nachweisenzym konjugiert wird. Dies bedeutet, dass der direkte ELISA einen einzelnen Antikörper verwendet, während der indirekte ELISA zwei Antikörper verwendet.

Direkter und indirekter ELISA sind zwei ELISA-Verfahren (Enzym-Linked Immunosorbant Assay), die zum Nachweis der Anwesenheit eines spezifischen Antigens oder Antikörpers im Medium verwendet werden.

Wichtige Bereiche

1. Was ist direkter ELISA?
     - Definition, Vorgehensweise, Merkmale
2. Was ist der indirekte ELISA?
     - Definition, Vorgehensweise, Merkmale
3. Was sind die Ähnlichkeiten zwischen direktem und indirektem ELISA?
     - Überblick über allgemeine Funktionen
4. Was ist der Unterschied zwischen direktem und indirektem ELISA?
     - Vergleich der wichtigsten Unterschiede

Schlüsselbegriffe

Direkter ELISA, Nachweisenzym, Indirekter ELISA, Primärantikörper, Sekundärantikörper, Substrat

Was ist direkter ELISA?

Direkter ELISA ist eine Methode des ELISA, die den Nachweis des Antigens mit einem enzymgebundenen primären Antikörper selbst ermöglicht. Diese ELISA-Methode wurde zuerst von Perlmann und Engvall entwickelt. Es wird als die einfachste Form des ELISA betrachtet. Die Schritte des direkten ELISA sind unten aufgeführt:

1. Beschichten der Oberfläche der Platte mit der Probe;
2. Inkubation der Platte mit dem enzymkonjugierten primären Antikörper;
3. Waschen zum Entfernen ungebundener Antikörper von der Platte;
4. Zugabe des Substrats für die enzymatische Reaktion;
5. Erkennung der von der Platte erzeugten Signale.

Die beiden Haupttypen von Enzymen, die mit dem primären Antikörper konjugiert sind, sind HRP (Meerrettichperoxidase) und alkalische Phosphatase. Die drei Arten von Substraten, die zusammen mit dem HRP verwendet werden, sind OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid), TMB (3, 3 ', 5, 5'-Tetramethylbenzidin) und ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazolin-6-). Sulfonsäure] -diammoniumsalz). Das zusammen mit der alkalischen Phosphatase verwendete Substrat ist PNPP (p-Nitrophenylphosphat, Dinatriumsalz). Die enzymatische Reaktion auf dem Substrat bewirkt eine Farbänderung im Medium, die von der Art des Substrats und dem für die Reaktion verwendeten Enzym abhängt. Dies erleichtert den Nachweis von Proben mit dem Zielantigen. 

Abbildung 1: Direkter ELISA

Direkter ELISA eignet sich besser zum Nachweis der Antigenmenge mit hohem Molekulargewicht in einer Probe. Die geringere Anzahl von Schritten bei dieser ELISA-Methode macht den Assay schneller. Aufgrund der Kosten und der Zeit, die mit der Markierung des primären Antikörpers mit Enzymen verbunden ist, ist der Einsatz von direktem ELISA jedoch eher selten. Auf der anderen Seite wirkt es sich auch nachteilig auf das Zielantigen aus.

Was ist der indirekte ELISA?

Indirekter ELISA ist eine andere Methode des ELISA, bei der zwei Antikörper zum Nachweis verwendet werden: primärer und sekundärer Antikörper. Die Schritte des indirekten ELISA sind wie folgt:

1. Beschichten der Oberfläche der Platte mit der Probe;
2. Inkubation der Platte mit dem primären Antikörper;
3. Waschen, um die ungebundenen Antikörper von der Platte zu entfernen;
4. Inkubation der Platte mit dem sekundären Antikörper, der mit dem Nachweisenzym konjugiert ist;
5. Waschen, um die ungebundenen Antikörper von der Platte zu entfernen;
6. Zugabe des Substrats für die enzymatische Reaktion;
7. Erkennung der von der Platte erzeugten Signale.

   Abbildung 2: Indirekter ELISA

Indirekter ELISA durchläuft zwei Antikörper-Bindungsschritte. Zum anderen wird der sekundäre Antikörper mit dem Nachweisenzym konjugiert. Im Allgemeinen gibt es viele sekundäre Antikörper, die mit Enzymen konjugiert sind. Der sekundäre Antikörper ist hier hauptsächlich ein polyklonaler Anti-Spezies-Antikörper. Aufgrund der Verfügbarkeit von Enzym-konjugierten Antikörpern wird das indirekte ELISA-Verfahren häufiger in immunologischen Tests zum Nachweis von Parasiten, Bakterien und Viren eingesetzt. Zum anderen können mehrere sekundäre Antikörper an den primären Antikörper in der Platte gebunden werden. Daher ist die Empfindlichkeit des Assays sehr hoch.

Ähnlichkeiten zwischen direktem und indirektem ELISA

• Direkter und indirekter ELISA sind zwei ELISA-Verfahren, bei denen das interessierende Antigen direkt an die Platte gebunden wird.
• Beide Verfahren umfassen den Nachweis der Anwesenheit eines spezifischen Proteinmoleküls in einer Probe. Dieses Proteinmolekül ist direkt an die Platte gebunden.
• Bei beiden Verfahren werden 96-Well-Platten oder 8-Well-Streifenrohre verwendet. Sowohl diese Platten als auch die Röhrchen bestehen aus Polystyrol. Die 96-Well-Platten bieten ausreichend Platz für die Bestimmung der optimalen Verdünnung für die Reaktion. Mittlerweile sind 8-Well-Röhren für die fein abgestimmten Assays besser geeignet.

Unterschied zwischen direktem und indirektem ELISA

Definition

Direkte Elisa bezieht sich auf einen ELISA-Typ, bei dem der primäre Antikörper mit dem Nachweisenzym konjugiert ist, während sich der indirekte ELISA auf einen ELISA-Typ bezieht, bei dem der sekundäre Antikörper mit dem Nachweisenzym konjugiert ist.

Anzahl der verwendeten Antikörper

Beim direkten ELISA wird ein Antikörper verwendet, bei dem es sich um den primären Antikörper handelt, während beim indirekten ELISA zwei Antikörper verwendet werden, den primären und den sekundären Antikörper. Dies ist der Hauptunterschied zwischen direktem und indirektem ELISA.

Nachweisenzym ist mit verknüpft

Darüber hinaus ist das Nachweisenzym im direkten ELISA an den primären Antikörper gebunden, während das Nachweisenzym im indirekten ELISA an den sekundären Antikörper gebunden ist.

Intensität der Signale

Ein weiterer Unterschied zwischen direktem und indirektem ELISA besteht darin, dass die durch direkten ELISA erzeugten Signale weniger intensiv sind, während die durch indirekten ELISA erzeugten Signale aufgrund der Signalverstärkung intensiver sind.

Hintergrundsignale

Der direkte ELISA erzeugt jedoch mehr Hintergrundsignale als der indirekte ELISA.

Empfindlichkeit

Direkter ELISA ist weniger empfindlich, während indirekter ELISA empfindlicher ist. Dies ist auch ein Unterschied zwischen direktem und indirektem ELISA. 

Kreuzreaktivität

Ein weiterer Unterschied zwischen direktem und indirektem ELISA ist die Kreuzreaktivität. Das heißt, die Kreuzreaktivität ist im direkten ELISA minimal, während sie im indirekten ELISA signifikant ist.

Zeit

Darüber hinaus ist der direkte ELISA aufgrund weniger Schritte weniger zeitaufwendig, während der indirekte ELISA aufgrund der doppelten Antikörperbindungsschritte zeitraubender ist.

Häufigkeit der Nutzung

Während direkter ELISA relativ selten ist, ist indirekter ELISA häufiger.

Fazit

Direkter ELISA verwendet den primären Antikörper nur zum Nachweis eines spezifischen Antigens. Dies bedeutet, dass der primäre Antikörper im direkten ELISA mit dem Nachweisenzym konjugiert wird. Indirekter ELISA verwendet jedoch einen primären Antikörper, um an das Antigen zu binden, während der enzymkonjugierte sekundäre Antikörper an den primären Antikörper bindet. Direkter ELISA ist aufgrund der geringeren Verfügbarkeit von Enzym-konjugierten primären Antikörpern weniger verbreitet. Der Hauptunterschied zwischen direktem und indirektem ELISA ist die Anzahl der verwendeten Antikörper.

Referenz:

1. "Arten von ELISA". Bio-Rad, Bio-Rad Laboratories, hier erhältlich

Bildhöflichkeit:

1. „ELISA-Diagramm“ Von Cavitri - Eigene Arbeit (CC BY 3.0) über Commons Wikimedia  
2. "Indirekter ELISA" Von Cawang - Eigene Arbeit (CC0) über Commons Wikimedia